2.1. Limpieza de los fragmentos de PCR y del plásmido pUC18 digeridos

Para la limpieza de fragmentos de ADN se utilizó un kit FavorPrep™, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Protocolo de limpieza:

2.1.1. Unión de DNA a la columna:

• Añadir 5 volúmenes de solución de unión (FADH buffer) sobre la muestra
• Colocar una columna sobre un tubo colector de 2 ml y cargar la muestra en el centro de la membrana.
• Incubar 30s a temperatura ambiente.
• Centrifugar 30s a 11000g.
• Descartar el eluyente y colocar la columna de nuevo en el tubo colector.

2.1.2. Lavados:

• Añadir 750µl de solución de lavado (WASH buffer).
• Centrifugar 30s a 11000g.
• Descartar el eluyente y volver a colocar la columna en el tubo colector.

2.1.3. Secado de la membrana:

• Centrifugar 3 min a 13000 g para eliminar restos de etanol de la solución de lavado.

2.1.4. Elución del DNA:

• Colocar la columna en un eppendorf de 1.5 ml.
• Añadir 40 µl de solución de elución (Elution buffer).
• Incubar 2 min a temperatura ambiente.
• Centrifugar 2 min a 11000g.

 

---

 

2.2. Ligación de fragmentos de ADN con la ADN ligasa del bacteriófago T4

La DNA ligasa se utilizó para unir covalentemente los fragmentos de ADN originados por las distintas enzimas de restricción. La ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre extremos 3’-hidroxilo y 5’-fosfato del ADN, bien dentro de la molécula o bien entre dos fragmentos distintos, y requiere ATP y Mg2+ como cofactores.
Procedimiento:

1. A una cantidad de ADN del vector se le añade una cantidad ADN del inserto en una proporción mayor (1:2 a 1:40).
2. Se añade el H2Od necesaria para alcanzar un volumen final de reacción de 20 μl.
3. A continuación se añade 2 μl de tampón de reacción 10x para la ADN ligasa y 2 μl (5 unidades) de ADN ligasa del fago T4.
4. Se incuba la reacción a 37°C durante una hora o a 4ºC y 14°C toda la noche especialmente si los fragmentos de ADN poseen extremos romos. Las nuevas moléculas generadas durante este proceso serán posteriormente introducidas en la cepa adecuada de Escherichia coli mediante transformación.

Tampón de reacción para la ADN ligasa del fago T4 (10x). ATP 10 mM; BSA 500 μg/ml; DTT 200 mM; MgCl2 100 mM y Tris-HCl 500 mM pH 7,8.

---

2.3. Preparación de geles de agarosa

Los alumnos prepararon sus geles de agarosa (ver Día 1, sección 1.3) para analizar la PCR realizada por ellos el día anterior

---

 

2.4. Preparación de medios de cultivo LB y LA

Loa alumnos prepararon medios de cultivo sólidos y líquidos para ser utilizados en las prácticas siguientes

Medio Luria-Bertani (LB) (Miller, 1972).

• Bacto-triptona 10 g
• NaCl 10 g
• Extracto de levadura 5 g
• agua destilada hasta 1 litro

 

Fig. 1. Elaboración de medios de cultivo LA y LB

El pH se ajusta a 7,5 con NaOH.
Para su utilización como medio sólido (Medio LA) se añadió un 1.5-2% de agar.
Se esteriliza en el autoclave (121ºC) durante 20 minutos.

Fig. 2. Ajustando el pH a los medios LA y LB

 

---

 

2.5. Electroforesis en geles de agarosa de la PCR realizada por los alumnos

Los alumnos realizaron una electroforesis en geles de agarosa al 0,8% para comprobar si habían amplificado el gen de resistencia a kanamicina (gen kan). Como puede observarse en las fotografías, la banda de PCR ha salido muy intensa en todos los casos y del tamaño esperado (813pb) como se puede comparar con el marcador de peso molecular (lambda PstI).

 Volver al Día 1                                      Continuar al Día 3º