IGM Día 1

Diseño de cebadores para amplificar el gen de resistencia a kanamicina (kan) del transposon Tn5 y su clonación posterior en el plásmido pUC18

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Esta técnica permite la amplificación de ácidos nucleicos  (1, 2, 3) ya que, mediante la utilización de unos oligonucleótidos o cebadores diseñados al efecto y partiendo de una molécula de ADN diana, se puede amplificar entre 10E5 y 10E9 veces una secuencia específica contenida en ella.

El método se basa en la repetición de un conjunto de tres pasos efectuados de forma sucesiva en unas condiciones determinadas y controladas de temperatura. Cada conjunto de estos tres pasos se denomina ciclo y consta de:

  1. Desnaturalización: Las dos cadenas del ADN utilizado como diana son separadas mediante la incubación a una temperatura elevada (92-96°C). Las hebras disociadas permanecerán en esta forma en la solución hasta que la temperatura baje lo suficiente como para permitir la unión de los cebadores.
  2. Anillamiento de los cebadores: Consiste en la unión de los cebadores al ADN diana. Los cebadores utilizados son un par de oligonucleótidos sintéticos capaces de unirse a secuencias de ADN que limitan físicamente la región que se pretende amplificar. Cada uno de ellos es una réplica de una de las dos cadenas del ADN y su diseño es tal que quedan enfrentados por sus extremos 3´ tras la unión a la molécula de ADN diana. La distancia entre ellos en el conjunto ADN-cebadores determinará la longitud de la secuencia de ADN amplificada.
  3. Extensión: Consiste en la elongación de los cebadores en el conjunto ADN-cebadores por la acción de una ADN polimerasa durante un tiempo que depende de la longitud del fragmento a amplificar. El resultado es la formación de las dos cadenas de ADN, copiadas de las moléculas diana, que han incorporado en el extremo 5´ de su secuencia la del respectivo cebador.

1.1. Diseño de cebadores

Se diseñan oligos para la amplificación del gen de resistencia a kanamicina (kan) con extremos EcoRI/HindIII para luego clonarlo en el polilinker del plásmido pUC18

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Fig. 1. Inicio y fin del gen de resistencia a kanamicina del Tn5

A partir de la secuencia del gen de resistencia a kanamicina se diseña un oligo directo (complementario a la cadena con sentido) y un oligo reverso (complementario a la cadena sin sentido). Posteriormente, se añaden los sitios de corte EcoRI y HindIII en los oligos directo y reverso respectivamente. «Aguas arriba» de los sitios de corte para estas enzimas de restricción se colocan unos nucleótidos extra para favorecer la digestión con estas enzimas.

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Fig. 2. Estrategia para el diseño de primers

Primer 1: Kan up EcoRI: 5′-CCG GAATTC ATG ATT GAA CAA GAT GG-3′, Tm: 57ºC
Primer 2: Kan down HindIII: 5′- TCCT AAGCTT TCA GAA GAA CTC GTC-3′, Tm: 56ºC

1.2. Reacción de PCR

Mezcla de reacción (volumen final 30 µl)

• Agua: 14.8 µl
• Buffer 10X (incluye MgCl2): 3µl
• dNTPs (2mM): 3 µl
• Primer 1 (5 µM): 2.4 µl
• Primer 2 (5 µM): 2.4 µl
• ADN molde: 2 µl
• Enzima Taq: 2,4 µl .

Ciclos de PCR Temperatura ºC Duración
1 1 95 2 min
2 30 95 30 seg
56 30 seg
72 1 min
3 1 72 5 min
PCR_machine.jpg
Fig. 3. Termociclador

Una alícuota de los productos de PCR obtenidos se correrán en un gel de agarosa junto con un marcador de tamaño molecular.

1.3. Electroforesis de ADN en geles de agarosa

Básicamente se siguieron los métodos descritos por Maniatis et al. (1982) y Sambrook et al. (1989). Se utilizó agarosa Gibco BRL (Life Technologies) disuelta por calentamiento en tampón TAE en concentraciones de entre el 0,3 y el 2% (p/v). La concentración de agarosa utilizada depende del rango de tamaño de los fragmentos de ADN a separar.

Concentración de agarosa % Tamaño de los fragmentos de ADN separados
0,3 3-60 kb
0,5 1-30 kb
0,7 0,8-12 kb
1,0 0,5-10 kb
1,2 0,4-7 kb
1,5 0,2-3 kb
2,0 0,05-2 kb

Las fotografías que aparecen en la wiki han sido cedidas por Lara Moreno, Noelia Díaz Morales, Raquel Carballo Castosa y Noelia Salgueiro Fernández, alumnas de 4º de Biotecnología de la Universidad de León

Preparación de geles de agarosa al 0,8%
1. Pesar 1,6 gramos de agarosa en polvo y ponerlos en una botella Pirex.
2. Enrasar en una probeta buffer TAE 1x hasta 200 ml, y añadirlo a la botella.
3. Calentar en el microondas hasta la completa disolución de la agarosa.
4. Dejar enfriar hasta que podamos coger el matraz sin quemarnos la mano.
5. Añadir RedSafe (7 µl/100 ml gel) y mezclar bien.
6. Verter sobre un molde de geles y poner los peines para los pocillos. Dejar solidificar y guardar a 4 ºC en oscuridad.

Material_para_preparar_un_gel_de_agarosa.jpg
Fig. 4. Materiales para preparar el gel de agarosa

Las muestras de ADN se mezclan con un décimo del volumen final del tampón de carga concentrado. El ADN se carga en el gel usando micropipetas.

Cargando_muestras_gel.jpg
Fig. 5. Cargando las muestras de DNA en el gel

La electroforesis se desarrolla en tampón TAE mediante la aplicación de una diferencia de potencial de entre 1 y 5 voltios/cm hasta que el colorante azul de bromofenol llegue al extremo del gel.

Midiendo_voltaje.jpg
Fig. 6. Estandarización del voltaje usado

La tinción del ADN se puede realizar:
a) con una solución de bromuro de etidio (BrEt) a una concentración final de 0,5 μg/ml. El BrEt se intercala en la doble cadena de ADN y permite su visualización tras iluminar el gel con luz UV. Los geles se fotografían sobre un transiluminador que emita luz ultravioleta de longitud de onda de 302 nm.
b) con una solución de RedSafe añadida en el gel de agarosa. Este agente es menos dañino que el BrEt. Observamos el gel a través de un transiluminador de luz azul (470 nm).
c) Otra opción es preparar el gel sin añadir el RedSafe, y luego teñirlo en una solución al 1X de RedSafe durante 10-30 min en oscuridad.

transiluminador_prácticas.jpg
Fig. 7. Transiluminador usado en prácticas

Tampones y soluciones usados en esta sección

  • Tampón TAE (50x): 57,1 ml de ácido acético glacial; 100 ml de EDTA 0,5 M pH 8,0; 242 g de Tris base y agua destilada hasta completar un litro.
  • Tampón de carga (6x): Azul de bromofenol 0,25% (p/v); Sacarosa 40% (p/v) y Xilencianol 0,25% (p/v). Se esteriliza en una olla a presión durante 20 minutos. Se conserva a 4ºC.
  • Solución de Bromuro de Etidio (BrEt): Se prepara una solución 10 mg/ml en agua y se conserva a 4°C protegida de la luz. Para un litro de agua destilada se requieren 50 μl de esta solución.
  • Solución de SYBR-safe (20.000x): Se prepara una solución 1x en el gel de agarosa/TAE y se conserva a temperatura ambiente y protegida de la luz.

1.4. Laboratorio virtual

Tomado de: neosci.com
Este programa refuerza los conceptos sobre la preparación de geles de agarosa, carga de muestras, tinción del gel….
Si no se hacen las cosas en el orden correcto, el programa no sigue.

1.5. Extracción del ADN a partir de geles de agarosa.

Para la extracción de fragmentos de ADN separados en geles de agarosa se utilizó Favor Prep GEL/PCR Purification Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se trata de un sistema comercial basado en la unión específica y reversible del ADN a partículas de sílica-gel. Este método permite extraer fragmentos de ADN de entre 100 pb y 10 kb.
Protocolo de extracción:1. Cortar la banda del gel.

  • Cortar cuidadosamente el fragmento del gel conteniendo la banda de ADN deseada (<300 mg) para minimizar el volumen.

2. Lisis del trozo de gel conteniendo la banda deseada:

  • Por cada fragmento de banda del gel, añadir 500 µl de solución de unión (FADH buffer).
  • Incubar la muestra a 55º-65ºC hasta que se disuelva completamente (10-15 min).

3. Unión de DNA a la columna:

  • Colocar una columna sobre un tubo colector de 2 ml y cargar la muestra (800µl) en el centro de la membrana.
  • Incubar 1 min a temperatura ambiente.
  • Centrifugar 30s a 11000g.
  • Descartar el eluyente y colocar la columna de nuevo en el tubo colector.

4. Lavados:

  • Añadir 750µl de solución de lavado (WASH buffer).
  • Centrifugar 30s a 11000g.
  • Descartar el eluyente y volver a colocar la columna en el tubo colector.

5. Secado de la membrana:

  • Centrifugar 3 min a 13000 g para eliminar restos de etanol de la solución de lavado.

6. Elución del ADN:

  • Colocar la columna en un eppendorf de 1.5 ml.
  • Añadir 40 µl de solución de elución (elution buffer).
  • Incubar 2min a temperatura ambiente.
  • Centrifugar 2 min a 11000g.

Tampones y soluciones usados en esta sección

  • Solución de unión: Isocianato de guanidina 4.5 M, acetato potásico (pH 5.0) 0.5 M.
  • Solución de lavado: 10 mM acetato potásico (pH 5.0), 80% etanol, 16.7 µM EDTA (pH 8.0).
  • Solución de elución: 5 mM Tris-HCl pH 8.5

1.6. Características del plásmido pUC18.

El plásmido utilizado para la clonación del gen de resistencia a kanamicina es el pUC18, que se le proporciona a los alumnos pero luego tendrán que aislarlo.
Características del pUC18

  1. Son vectores de clonación de tamaño pequeño (2686pb).
  2. Se mantienen de forma estable en E. coli en alto número de copias (20-30 copias por célula).
  3. Contiene un sitio de múltiple de clonación para la inserción de fragmentos de ADN exógeno.
  4. Posee el replicón pMB1 responsable de la replicación del plásmido en E.coli.
  5. Presenta el gen bla, que codifica una beta-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina.
  6. Contiene el promotor lac, y bajo su control aparece la porción 5’ del gen //lacZ// que codifica para el fragmento N-terminal de la beta-galactosidasa. La síntesis de este fragmento se induce por IPTG y es capaz de complementar la forma truncada de la beta-galactosidasa codificada por la cepa hospedadora. En presencia de IPTG, la bacteria transformada con este plásmido sintetiza los dos fragmentos de la enzima y forma colonias azules en medio con X-Gal. La inserción de DNA en sito multiple de clonación situado dentro del gen lacZ inactiva el fragmento N-terminal de la beta-galactosidasa y no se produce la complementación, así que las colonias que contienen el plásmido recombinante mantienen el color blanco.
  7. Se conoce la secuencia completa. Número de acceso de la secuencia GenBank/EMBL: L09136.
pUC18.JPG
Fig. 8. Mapa físico del plásmido pUC18 y secuencia de nucleótidos y aminoácidos del polilinker

1.7. Digestión del producto de PCR y del plásmido.

Las enzimas de restricción fueron utilizadas siguiendo las recomendaciones de los distintos proveedores. Como norma general, el volumen de las enzimas no debe superar 1/10 del volumen total de la mezcla de reacción debido a la alta concentración de glicerol presente en las soluciones de almacenamiento (se conservan a -20 ºC) de las mismas.
Esquema general de la digestión de ADN con una endonucleasa de restricción

  • 1. En un tubo Eppendorf se mezclan, en el orden mencionado, los siguientes componentes de la reacción:

– Agua destilada estéril hasta completar el volumen final de la mezcla de digestión.
– Tampón de digestión en la concentración óptima descrita (normalmente se requiere un volumen que sea la décima parte del volumen final de la mezcla, debido a que el tampón se distribuye con una concentración 10 veces mayor de la recomendada para su uso).
– n μg de ADN disuelto en agua destilada oen tampón TE (si el ADN está disuelto en tampón TE es recomendable que el volumen utilizado en la mezcla no supere la décima parte del total de la reacción, para evitar modificar las características del tampón de digestión).
– n unidades de enzima.

Mezcla de reacción (PCR):
Vf = 30 µl
20 µl banda PCR
3 µl buffer R 10x
2 µl EcoRI
2 µl HindIII
3 µl Agua Milli Q

Mezcla de reacción (pUC18):
Vf = 20 µl
10 µl plásmido
2 µl buffer R 10x
2 µl EcoRI
2 µl HindIII
4 µl Agua Milli Q

  • 2.- Posteriormente se incuba a la temperatura óptima de actividad de la/s enzima/s (en nuestro caso, 37ºC) toda la noche. El ADN se analiza por migración electroforética en geles de agarosa o se limpia.

Tampón usado en esta sección:

  • Buffer R: 10 mM Tris-HCl (pH 8.5 a 37ºC), 10 mM MgCl2, 100 mM KCl y 0.1 mg/ml BSA.

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1.8. Bibliografía

  1. Saiki, R K, S Scharf, F Faloona, K B Mullis, G T Horn, H A Erlich, y N Arnheim. 1985. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science (New York, N.Y.) 230, no. 4732 (Diciembre 20): 1350-1354. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2999980.
  2. Mullis, K B, y F A Faloona. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155: 335-350. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3431465.
  3. Saiki, R K, D H Gelfand, S Stoffel, S J Scharf, R Higuchi, G T Horn, K B Mullis, y H A Erlich. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science (New York, N.Y.) 239, no. 4839 (Enero 29): 487-491. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2448875.