Resumen
Algunos metales/metaloides constituyen sistemas de estrés celular, y por tanto las células tienden deshacerse de ellos. Uno de estos metaloides es el arsénico, que en su forma inorgánica y en aerobiosis se presenta como arseniato. Una manera de desintoxicación celular es la reducción del arseniato a arsenito mediante unas enzimas denominadas arseniato reductasas citoplasmáticas (ArsCs). Los procesos evolutivos han generado ArsCs con diferentes plegamientos que generan diferentes cascadas tiol-disulfuro. En Corynebacterium glutamicum se han descrito dos enzimas ArsCs que se acoplan al buffer redox micotiol (MSH) y a una nueva enzima denominada micoredoxina (Mrx) constituyendo el par MSH/Mrx. La existencia de micorredoxinas ha sido descrita por nuestro grupo en representantes de actinobacterias, siendo importante su presencia en Mycobacterium tuberculosis. Dado el papel que las Mrxs pueden jugar como moduladores de la actividad de otras proteínas celulares (oxidándolas o reduciéndolas), nos planteamos como objetivo principal en este proyecto la búsqueda de posibles dianas celulares de estas Mrxs en C. glutamicum y M. tuberculosis con objeto de determinar los procesos fisiológicos en los que están implicados. Este nivel de conocimiento nos permitiría regular la expresión de determinados genes, inhibir determinados procesos metabólicos y/o desarrollar drogas o antimetabolitos específicos para estas actinobacterias.
Objetivos del proyecto
1. Análisis in vivo e in vitro de la arseniato reductasa ArsC1’ de C. glutamicum; determinación de su mecanismo de acción
2. Clonación del operón de resistencia a As de Mycobacterium tuberculosis en mutantes de C. glutamicum.
3. Búsqueda de posibles nuevas micoredoxinas en C. glutamicum y M. tuberculosis y obtención de mutantes knockout.
4. Utilización de la micoredoxina1 de C. glutamicum para su aplicación en un sistema de atrapamiento proteico.
5. Localización y análisis de genes-enzimas de M. tuberculosis con mecanismos de acción basados en micorredoxinas
6. Análisis estructural de las proteínas y enzimas objeto del presente estudio
Resultados obtenidos
– Se caracterizó física y funcionalmente la enzima ArsC1’ de C. glutamicum (Cglu) de forma que el mecanismo de acción de esta enzima resultó ser diferente al observado para las enzimas ArsC1 y ArsC2
– Se han realizado análisis de resistencia a As en otras actinobacterias: Mycobacterium, Rhodococcus, etc; en general las bacterias saprófitas de este grupo presentan resistencias a arseniato y arsenito, mientras que las parásitas (que afecten a animales) suelen presentar niveles de resistencia bajos.
– En M. tuberculosis (Mtub) existen dos genes implicados en resistencia a As, pero los dos cistrones están fusionados; el nivel de resistencia de la cepa virulenta M. tuberculosis H37Rv presentó valores de resistencia a AsV menores a 1 mM, y de 1.5 mM para AsIII. La clonación de los genes ars de Mtub en C. glutamicum no implicó aumento significativo de la resistencia en este último.
– Se localizaron 3 potenciales micorredoxinas en Cglu y Mtub: Mrx1, Mrx2 y Mrx3. De ellas, la Mrx2 ha sido descrita como una ribonucleótido reductasa (NrdH) tanto en Cglu como en Mtub.
– No se ha logrado identificar la función en la que está implicada Mrx3 en actinobacterias, aunque en Cglu realiza un papel esencial en la resistencia a arseniato.
– Se han determinado las estructuras tridimensionales de las enzimas implicadas en lo0s procesos indicados anteriormente: Mrx de Cglu y Mtub; NrdH de Cglu y Mtub; ArsC2 y ArsC1’ de Cglu.