PROYECTO FINANCIADO POR COMUNIDAD AUTÓNOMA DE CASTILLA Y LEÓN (periodo 2004-05)
TÍTULO: Desarrollo y evaluación de un sistema de separación basado en una bacteria recombinante para concentrar diversas especies de arsénico
RESUMEN:En este proyecto se manipulará genéticamente una corinebacteria para conseguir bloquear los genes responsables de la entrada de los metaloides As(V) y As(III), la reducción de As(V) a As(III) y posterior eliminación de As(III). Se evaluará la capacidad de dichas bacterias para separar especies arsenicales con el fin de reducir sus niveles de contaminación en aguas residuales. Los resultados obtenidos del estudio de retención se aprovecharán para desarrollar métodos de análisis que permitan evaluar el impacto ambiental producido por dichas especies de arsénico. El efecto de todas las variables que influyen en el proceso de retención por las células será controlado combinando medidas mediante espectroscopia atómica con el uso de isótopos radiactivos y la espectrometría de infrarrojo con transformada de Fourier. La localización celular del arsénico será evaluada mediante microscopia electrónica de barrido, la cual incorpora la posibilidad de llevar a cabo microanálisis mediante espectrometría de rayos X de energías dispersivas. Los métodos de análisis desarrollados estarán basados en la espectrometría de absorción atómica electrotérmica y en la espectrometría de infrarrojo y se aplicarán a la determinación de arsénico en patrones certificados y muestras ambientales.
SUMMARY: In this work, genetically modified corynebacteria will be prepared in order to block those genes responsible of the As(V) and As(III) uptake, reduction of As(V) to As(III) and further elimination of As(III). Capabilities of these bacteria to separate arsenic species will be evaluated with the aim to decrease their contamination levels in waste waters. The results found from the uptake study will be used to develop analytical methods which allows to evaluate the environmental impact of that arsenic species. The effect of all the variables affecting the retention process by the cells will be followed by combining measurements by atomic spectrometry with isotope measurements and Fourier transform infrared spectrometry. Cellular localization of arsenic species will be evaluated by using secondary electron microscopy which includes the capability of using microanalysis by energy dispersive X-ray spectrometry. The developed analytical methods will be based on electro-thermal atomic absorption spectrometry and Fourier-transform infrared spectrometry and will be applied to the determination of arsenic-based toxicants in certified reference materials and environmental samples.
Objetivos:
1. Obtención de mutantes de la corinebacteria C. glutamicum ATCC 13032 afectados a diferentes niveles en algunos de los procesos de transporte y/o desintoxicación de las especies de arsénico.
2. Empleo de los mutantes bacterianos modificados para separar selectivamente y preconcentrar distintas especies de arsénico [As(III) y As(V)], de aguas residuales, alimentos, etc.
3. Optimización de los parámetros operatorios que afectan al proceso de retención por las bacterias de cada una de las especies de arsénico citadas, mediante el empleo combinado de emisores de radiación gamma y X, espectroscopias de absorción/emisión atómica, y espectrometría de infrarrojo con transformada de Fourier.
4. Desarrollo de un método de análisis por espectrometría de absorción atómica electro-térmica que permita cuantificar concentraciones de arsenito y arseniato (previa separación con bacterias recombinantes) inferiores a nanogramos/ml.
5. Abordar la posibilidad de determinar indirectamente especies de arsénico (arsenito y arseniato), a través de los cambios experimentados en las membranas de la bacteria, usando espectrometría de infrarrojo con transformada de Fourier.
Resultados obtenidos:
– Se obtuvieron mutantes de C. glutamicum afectados en las enzimas arseniato reductasas (transformación de arseniato en arsenito) y en las arsenito permesasas (acumulación de arsenito)
– Se logró la especiación de formas de arsénico a través de los mutantes indicados.
– Se optimizaron las condiciones para la incorporación de las formas inorgánicas de As en condiciones de crecimiento celular en medio de cultivo líquido y en fase estacionaria (“resting cells”)
– Se establecieron diferentes métodos de análisis de las células obtenidas aplicando diferentes sistemas de cuantificación