PROYECTO MINISTERIO EDUCACIÓN-CIENCIA (periodo 2006-08).
TÍTULO: Sistemas moleculares de desintoxicación de arsénico por Corynebacterium glutamicum y desarrollo de cepas para la acumulación del metaloide.
RESUMEN: El arsénico es un metaloide extremadamente tóxico, con actividad carcinogénica y que afecta negativamente a la salud humana. El arsénico inorgánico [arseniato As(V) y arsenito As(III)] se encuentra en suelos y aguas como contaminante natural, pero también procedente de la actividad minera e industrial. Se han descrito métodos físico-químicos para la eliminación de arsénico de las aguas contaminadas (adsorción con alúmina, intercambio aniónico, etc.) pero son caros y poco efectivos. Los métodos biológicos están siendo desarrollados y hasta la fecha se ha descrito la fitorremediación de arsénico con helechos y la remediación con cepas recombinantes de E. coli. Los microorganismos han desarrollado diferentes mecanismos para subsistir en cantidades elevadas de arsénico, y las corinebacterias se encuentran entre los microorganismos que presentan los mayores niveles de resistencia a As(III) y As(V) descritos hasta el momento. Esto puede ser debido, entre otras razones, a la presencia de dos operones cromosomales (ars1 y ars2) y otros genes accesorios (arsB3 y arsC4) implicados en la desintoxicación de arsénico, que podrían hacer de Corynebacterium glutamicum un microorganismo adecuado para su uso en procesos de bioacumulación de arsénico.
El objetivo prioritario del proyecto de investigación es incrementar la toma de arsénico [As(III) o As(V)] por C. glutamicum, acumular As(V) o As(III) en las células e impedir la salida de As(III) de las células con el objetivo final de poder llevar esta tecnología al mercado de la biorremediación de arsénico. Más específicamente, el conocimiento adecuado de los sistemas de “uptake” de As(III) y As(V) en C. glutamicum y su posible manipulación genética, permitirá incrementar de entrada de As(III) o As(V) en la célula. La acumulación de As(V) podría ser potenciada por la superexpresión de polifosfato quinasas (arseniato y fosfato son análogos estructurales) e interrupción de los genes implicados en la reducción de As(V) a As(III). La superexpresión de proteínas complejantes (con un número elevado de residuos de Cys) o de los reguladores ArsR (represores de operones ars), conjuntamente con la interrupción de los genes que codifican para las permeasas de As(III) permitiría la acumulación de As(III).
SUMMARY: Arsenic is an extremely toxic and carcinogenic metalloid that adversely affects human health. Arsenic [arsenite As(III) and arsenate As(V)] is a natural contaminant in soils and water, but additional contaminations arise also from mining and industrial activities. Several physics-chemical methods (alumina sorption, polymeric anion exchange…) are currently used to remove arsenic from contaminated water but they are expensive and do not efficiently remove As(III). Biological methods are being developed and, up to now, a publication describing arsenic hyperaccumulation by a fern plant and another by E. coli are available. It is well known that microorganisms survive in the presence of high concentrations of arsenic, being corynebacteria one of the most As(III) or As(V) resistant microorganisms described up to date. This can be due, among other reasons, to the presence of two chromosomal operons (ars1 and ars2) and accessory genes (arsB3 and arsC4) involved in arsenic detoxification, and thus Corynebacterium glutamicum could be used as a model for arsenic bioaccumulation. The primary objective of this research project is to increase the uptake of arsenic [As(III) or As(V)] by C. glutamicum, the accumulation of As(V) or As(III) in the cells and to prevent the As(III) export with the ultimate goal of bringing this technology to the remediation market. More specifically, the mechanisms of As(III) and As(V) uptake and their possible genetic manipulation will allow us to increase the intracellular levels of As(III) or As(V). Accumulation of As(V) would be improved either by the superexpression of polyphosphate kinases (phosphate and arsenate are structural analogues) or by genetic disruption of genes involved in the reduction of As(V) to As(III). Superexpression of complex proteins (having a high number of Cys residues) or the ArsR regulatory proteins (from the ars operons) together with the genetic disruption of As(III)-permease genes would lead to strains able to accumulate As(III).
Objetivos del proyecto
1. Análisis funcional de los genes ars de Corynebacterium glutamicum
2.- Análisis transcripcional de los genes ars y de sus señales reguladoras
3.- Efecto del incremento de la dosis génica (operón ars) en la resistencia a arsénico de C. glutamicum
4.- Análisis de acumulación de As(V) en cepas silvestres y en mutantes de ArsC.
5.- Análisis de acumulación de As(III) en cepas silvestres y en mutantes de ArsB/Acr3
6.- Uso de proteínas de fusión extracelulares en procesos de adsorción-neutralización de arsénico.
7.- Análisis cuantitativo de bioacumulación de As(V) y As(III).
Resultados obtenidos
– Se clonaron de forma individual genes de C. glutamicum afectados en las enzimas arseniato reductasas (transformación de arseniato en arsenito) y en las arsenito permesasas (acumulación de arsenito); para ello se clonaron los genes en monocopia (incluidos en el cromosoma) o en multicopia (mediante plásmidos bifuncionales).
– Se estudiaron las señales reguladoras existentes en los dos operones ars de C. glutamicum.
– Se cuantificaron las cantidades de As acumulado en las células en estado de reposo (“resting cells”) mediante técnicas de ICP-masas.
– Se establecieron diferentes parámetros y ecuaciones para establecer el mecanismo de incorporación, acumulación y salida y de las diferentes formas de arsénico